Unidad 4 · Manipulación genética

Las herramientas moleculares: ADN recombinante, enzimas de restricción y PCR

Manipular genes suena a ciencia ficción, pero se reduce a tres verbos muy concretos: cortar, pegar y copiar ADN. Este artículo explica las herramientas que hacen esas tres cosas —las tijeras moleculares, el pegamento, los vehículos y la fotocopiadora de genes— porque son la base común de la insulina de laboratorio, los transgénicos y los diagnósticos genéticos.

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En la ingeniería genética el objetivo es tomar un gen —una instrucción escrita en ADN— y hacer que una célula lo lea y fabrique la proteína correspondiente. Para lograrlo hacen falta herramientas que trabajen sobre una molécula invisible, más delgada que cualquier hilo. La biología resolvió el problema tomando prestadas herramientas que las propias bacterias ya usaban. En este artículo veremos dos tecnologías complementarias: la del ADN recombinante, que corta y pega genes, y la PCR, que los copia en cantidades enormes.

1. La tecnología del ADN recombinante

Se llama ADN recombinante a una molécula de ADN construida artificialmente uniendo fragmentos de distinto origen: por ejemplo, un gen humano insertado dentro del ADN de una bacteria. "Recombinante" significa, literalmente, que se han combinado trozos que en la naturaleza nunca habrían estado juntos.

Construirlo requiere cuatro elementos que iremos presentando: unas tijeras (las enzimas de restricción), un vehículo (el plásmido), un pegamento (la ADN ligasa) y una célula que reciba el resultado (la bacteria transformada).

Las tijeras: enzimas de restricción

Una enzima de restricción es una proteína que reconoce una secuencia específica de bases del ADN y lo corta justo en ese punto. No corta en cualquier lugar: cada enzima "lee" una palabra corta de ADN —por ejemplo GAATTC— y solo actúa donde encuentra exactamente esa secuencia. Las bacterias las producen de forma natural para destruir el ADN de los virus que las infectan; la biotecnología las aprovecha como bisturís de precisión.

Muchas enzimas de restricción no cortan las dos hebras a la misma altura, sino de forma escalonada. Eso deja unos pocos nucleótidos sin aparear que sobresalen en cada extremo: son los extremos cohesivos (o "pegajosos"). Como sobresalen bases complementarias, dos fragmentos cortados por la misma enzima pueden volver a encajar entre sí, aunque provengan de organismos distintos. Ese detalle es la clave de todo el método.

El vehículo: el plásmido

Para que un gen viaje hasta el interior de una bacteria necesita un transporte. Ese transporte suele ser un plásmido: una pequeña molécula de ADN circular, independiente del cromosoma bacteriano, que las bacterias poseen de forma natural y que se replica por su cuenta. El programa lo describe como un "vehículo de ADN circular". En términos generales, cualquier estructura que transporte e introduzca ADN en una célula receptora se llama vector; el plásmido es el vector más usado, pero también se emplean virus modificados.

Un plásmido útil para clonar no es un anillo cualquiera: lleva rótulos que lo hacen manejable. Casi siempre incluye tres regiones que conviene reconocer.

El marcador de selección merece una mención aparte, porque es fácil de olvidar. La transformación no es perfecta: de todas las bacterias del cultivo, solo unas pocas incorporan el plásmido. El gen de resistencia a un antibiótico resuelve el problema: si después se cultivan las bacterias en presencia de ese antibiótico, solo sobreviven las que recibieron el plásmido. Así se identifican y seleccionan sin ambigüedad las células modificadas.

El pegamento: la ADN ligasa

Una vez que el gen de interés y el plásmido han sido cortados por la misma enzima de restricción, sus extremos cohesivos se aparean por complementariedad de bases. Pero ese emparejamiento es todavía frágil: falta sellar la unión. De eso se encarga la ADN ligasa, una enzima que forma los enlaces covalentes que cierran de manera definitiva la cadena, uniendo el gen y el plásmido en una sola molécula: el plásmido recombinante.

La entrega: la transformación

El plásmido recombinante se introduce entonces en una bacteria —típicamente Escherichia coli—. La incorporación de ADN externo por una bacteria se llama transformación. Aquí ocurre lo más elegante del método: la bacteria trata al plásmido como si fuera propio y, cada vez que se divide, lo copia junto con su gen insertado. Como una bacteria se multiplica hasta millones de veces en pocas horas, se obtienen millones de copias idénticas del gen. A esa multiplicación se le llama clonación de un gen o clonación molecular.

2. La PCR: la fotocopiadora de ADN

La técnica del ADN recombinante usa células vivas para copiar un gen. La PCR —sigla de reacción en cadena de la polimerasa, del inglés Polymerase Chain Reaction— hace algo parecido pero sin bacterias, directamente en un tubo de ensayo (in vitro). Inventada por Kary Mullis en 1983, permite tomar un fragmento de ADN y amplificarlo hasta obtener millones o miles de millones de copias en un par de horas. Es, en esencia, una fotocopiadora molecular.

En el tubo se colocan cuatro ingredientes: el ADN que se quiere copiar (el molde), los partidores o primers —trozos cortos de ADN que marcan dónde empieza y dónde termina la región a copiar—, los nucleótidos sueltos (las "letras" con que se construye el ADN nuevo) y una enzima especial, la Taq polimerasa. Después, la máquina (un termociclador) repite un ciclo de tres pasos una y otra vez, cambiando la temperatura.

Los tres pasos de cada ciclo

1. Desnaturalización (~94 °C): el calor rompe los puentes que unen las dos hebras de la doble hélice y las separa. Ahora cada hebra puede servir de molde.
2. Hibridación (~55 °C): al bajar la temperatura, los partidores se unen (se aparean) a la zona complementaria de cada hebra, señalando el punto de inicio de la copia.
3. Extensión (~72 °C): la Taq polimerasa parte desde cada partidor y sintetiza la hebra nueva, añadiendo nucleótidos uno a uno hasta completar la copia.

¿Por qué una enzima tan particular? Porque el paso de desnaturalización somete la mezcla a casi 100 °C, temperatura que destruiría a la mayoría de las proteínas. La Taq polimerasa proviene de Thermus aquaticus, una bacteria que vive en aguas termales, y es termoestable: resiste el calor sin dañarse. Gracias a eso puede seguir trabajando ciclo tras ciclo sin necesidad de reponerla.

Dos herramientas, un mismo propósito

El ADN recombinante y la PCR resuelven necesidades distintas y a menudo se usan juntas. La PCR permite obtener rápidamente muchas copias de un gen de interés para tener material de partida; la tecnología del ADN recombinante permite insertar ese gen en un plásmido y hacer que una célula lo lea y fabrique su proteína. La siguiente tabla resume las diferencias.

Juntas, estas dos herramientas son la base común de buena parte de la biotecnología actual:

• La insulina recombinante: el gen humano de la insulina se inserta en un plásmido y se clona en bacterias, que la fabrican para tratar la diabetes (lo verás en el artículo de fármacos biotecnológicos).
• Los organismos transgénicos: plantas y animales a los que se les inserta un gen de otra especie usando estas mismas técnicas (ver organismos transgénicos y alimentos).
• Los diagnósticos genéticos: la PCR amplifica y detecta el ADN de un virus o una mutación aunque haya muy poco en la muestra —el mismo principio de los tests de PCR que se volvieron familiares durante las pandemias—.

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